Analyse par Cytométrie de Flux, Tri cellulaire et Luminex

Bouton Résa

 

Service de Cytométrie de Flux, Tri cellulaire et Luminex

La cytométrie en flux est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension (cellules, bactéries, parasites, billes…) entraînées par un flux liquide et excitées par un laser. Les signaux optiques ou physiques émis par une particule sont essentiellement relatifs :

• aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés au taille de la particule, à leur structure interne ou à l’auto fluorescence de certaines cellules comme les végétaux, le phytoplancton, etc.

• aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires.
Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs (PMT), amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur par l’intermédiaire d’une composante optique et informatique.
Ce procédé d’analyse individuelle (particule par particule) est multiparamétrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde.
Un logiciel d’analyse permet le calcul des données statistiques associées aux distributions des paramètres mesurés et la représentation sous la forme d’histogrammes (un paramètre) ou de cytogrammes (deux paramètres) sur une ou plusieurs populations dont les propriétés cellulaires sont ainsi évaluées.
Les principales applications sont le phénotypage des cellules (antigènes membranaires et intracellulaires), la mesure de l’apoptose et/ou la viabilité cellulaire (eucaryotes et procaryotes), la quantification de l’ADN (étude du cycle et de la ploïdie cellulaire…), la mesure de la prolifération cellulaire, le suivi de l’activité génétique par l’expression d’un gène rapporteur (GFP), le dosage de cytokines par CBA…..et aussi ; étude de la signalisation cellulaire, stress oxydative, flux ioniques, tri cellulaire…..

La plateforme ImageUP dispose de:

  • un cytomètre Analyseur BD FACS Verse

Verse

L’analyseur BD FacsVerse est équipé de trois lasers à 405 nm, 488nm, 633nm. Il permet l’analyse simultanée de 10 paramètres : FCS, SSC et 8 fluorescences.

Fluochromes utilisables

le système fluidique es est non pressurisé, et dispose de 3 vitesses d’acquisition : 12, 60 et 120µl/min et un mode « High Sensitivity »
Acquisition de l’échantillon en tubes: 5mL, 15 ml, 50ml en polystyrène ou polypropylène et micro tubes 2mL
Il est équipé d’un passeur de tubes (30 et 40 tubes), et d’un passeur de plaques.
Le cytomètre est piloté par le logiciel FACSuite.

La chambre d’analyse est en acier inoxydable permettant renforcer la stabilité pendant l’acquisition

chambre

Pour en savoir plus :
www.bdbiosciences.com/verse
http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_TechSpecs.pdf

  • un Cytomètre Analyseur et Trieur BD FACS Aria III

La plateforme Image UP dispose d’un cytomètre analyseur et trieur de cellules: BD FACS Aria III

Trieur

Le tri peut être défini comme la séparation physique de cellules ou de particules d’intérêt à partir d’une population hétérogène.
Le cytomètre en flux utilise le principe de la déflection électrostatique de gouttes chargées comme dans les imprimantes à jet d’encre. Les cellules sont aspirées de l’échantillon et injectées une à une par une buse dans un courant continu de PBS.
En appliquant au jet, une onde de vibration d’une fréquence et d’une amplitude déterminée, il va se rompre pour donner des gouttes à un point précis caractérisé par sa position et son temps d’apparition appelé « break of point ». Au moment de l’interception de la cellule avec le faisceau laser, la lumière déviée et la fluorescence émise génèrent un signal qui est traité par le programme de tri afin de décider si la cellule doit être isolé ou non selon les critères définis par l’utilisateur. La distance entre l’interception du laser avec la cellule et le « break of point » est appelé le « drop delay ». Si une cellule d’intérêt devant être triée a été détectée, le cytomètre attend qu’elle arrive jusqu’au « break of point »pour charger la goutte. Comme celle-ci contient la cellule à trier, en passant entre les plaques de déflection fortement chargées, elle est déviée du côté de la plaque de polarité opposée et collectée. En appliquant différent niveau de charge à gauche et à droite, il est possible de trier plusieurs populations simultanément.

  • Luminex 200

Enfin la plateforme dispose aussi d’un luminex  que l’on peut réserver sur le site de réservation d’ImageUP mais qui est géré par les laboratoires LITEC et CiMoTheMa.

Le Luminex 200 utilise la Technologie Luminex™ Xmap (Multi-Analyte Profiling).Cette technologie est fondée sur le principe de la cytométrie en flux, allie l’utilisation de microbilles fluorescentes et une double lecture après excitation par deux lasers (rouge et vert). Actuellement, un panel de 100 billes renfermant un ratio différent de fluorescence rouge et orange est utilisable. Chaque bille, excitée par le laser rouge, a ainsi son propre code couleur d’identification permettant identifier et analyser plusieurs molécules simultanément dans un même échantillon(MULTIPLEX). Ces différentes billes peuvent être couplées à leur surface avec des sondes oligonucléotidiques, des antigènes purifiés  ou des anticorps de capture, permettant ainsi la détection d’allèles, d’anticorps ou des antigènes.         

Billes de polystyrène ou magnétiques excités par le laser rouge (633 nm). Une quantité précise des deux fluorochromes (rouge et orange) est incorporée à  chaque bille.

 Les billes couplées sont incubées avec les échantillons à analyser. Après avoir suivi un protocole expérimental de type ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), les résultats sont obtenus par lecture sur le  Luminex  200.

Le laser vert (532) excite le fluorochrome (phycoérythrine) qui est couplé à une molécule reporter (Anti-immunoglobuline, produit d’amplification…). La fluorescence émise témoigne de la réaction sur la surface de billes et permet la quantification des analytes à l’aide d’une gamme d’étalonnage.

Le logiciel, Luminex  xPONENT, permet l’acquisition et analyses des donnés. Le logiciel d’analyse (MILLIPLEX Analyst) est à disposition des utilisateurs pour un traitement des donnés plus sophistiqué.

Les avantages de la technologie Luminex:

  • Détermination simultanée jusqu’à 100 analytes différents dans un seul échantillon avec un volume d’échantillon très faible
  • Quantification précise
  • Linéarité du signal mesuré jusqu’à 4 ordres de grandeur
  • Haute sensibilité et spécificité

Il s’agit d’un système ouvert : il est possible de lire des plaques provenant de kits de différents fournisseurs (Biorad, Millipore, eBiosciences, Life Technologies, R & D….)

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